奶牛乳腺上皮细胞的分离鉴定及DBP诱导β-酪蛋白的分泌研究

【摘要】乳腺生物反应器充分利用动物乳腺组织具有合成和分泌乳汁的功能,目前被广泛使用于生产功能蛋白等,现已成为极具开发应用前景的生物技术。乳腺上皮细胞是乳腺组织中特异性具有分泌功能的细胞,在体外分离培养的乳腺上皮细胞同样拥有与在体内组织相似的分泌功能,建立乳腺上皮细胞体外培养系统为研究乳腺组织的泌乳机理、验证和检测乳腺特异表达载体功能具有重要意义。本研究对牛乳腺上皮细胞进行分离、培养和鉴定,并用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)诱导体外培养的乳腺上皮细胞表达β-酪蛋白。论文的研究内容主要包括两个部分：1.利用泌乳期的奶牛乳腺组织,在体外进行乳腺上皮细胞的分离、纯化和鉴定。本研究利用组织块培养法、酶消化培养法、机械培养法进行分离细胞,利用差速贴壁结合差速脱壁纯化分离的乳腺上皮细胞。对分离细胞的显微观察表明,三种方法培养细胞可以获得成纤维样细胞和上皮样细胞混合生长的细胞,培养细胞形态完整；差速脱壁法和差速贴壁法结合纯化细胞,成纤维样细胞完全消失,所得细胞全部为为鹅卵石状或卵圆形的上皮样细胞。纯化的细胞传代培养,细胞进行显微观察、生长曲线绘制、核型制备,结果表明培养的细胞形态良好、具有正常的上皮细胞形态、细胞生长正常并且核型完整、有正常的染色体数目。应用免疫荧光方法鉴定乳腺上皮细胞特异表达的角蛋白5、角蛋白8和角蛋白18的表达情况,研究表明,纯化的细胞表达特异性角蛋白5、8、18并且其表达率达到90%。PCR检测牛乳腺上皮细胞β-casein在mRNA水平的表达,结果表明,所培养的细胞能够转录表达β-酪蛋白。2.研究DBP对乳腺上皮细胞β-酪蛋白分泌诱导作用。β-酪蛋白是乳腺中高表达的乳蛋白成分,本实验中利用中草药王不留行的活性单体DBP来诱导乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达,以添加胰岛素、氢化可的松、胰岛素样生长因子、催乳素的无血清培养液为对照的诱导液组。首先分别用0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml浓度的DBP处理液培养细胞。MTT比色检测结果表明0.4-0.8(mg/ml)浓度时细胞增殖明显。细胞经0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/mlDBP诱导液和对照组诱导液培养,显微观察细胞形态、流式细胞仪检测诱导液对细胞的活率的影响,结果表明细胞生长状态良好,均无明显差异。牛乳腺上皮细胞经不同诱导液诱导培养,应用实时荧光定量PCR检测细胞β-酪蛋白在mRNA水平的表达,结果表明,经0.5mg/ml的DBP诱导液培养的牛乳腺上皮细胞其β-酪蛋白在mRNA的表达显著提高。本研究为转基因乳腺生物反应器的制作及构建乳腺特异性表达载体的活性检测奠定基础。总之,本研究成功分离培养了牛乳腺上皮细胞,并建立了一种新的、更为高效的诱导牛乳腺上皮细胞表达β-酪蛋白的方法。这为制备转基因乳腺生物反应器奠定了基础、为检测乳腺特异性表达载体的活性提供了有力工具。
【作者】宝鲁日；
【导师】于海泉；
【作者基本信息】内蒙古大学，动物学，2014，硕士
【关键词】乳腺上皮细胞；细胞分离和纯化；DBP；诱导表达；β-酪蛋白；

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